分光光度法测定叶绿素含量

　　一、实验目的
　　1.了解植物组织中叶绿素的分布及性质。
　　2.掌握测定叶绿素含量的原理和方法。

　　二、实验原理
　　叶绿素广泛存在于果蔬等绿色植物组织中，并在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体。当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对光、热较敏感；在酸性条件下叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀碱液中可水解成鲜绿色的叶绿酸盐以及叶绿醇和甲醇。高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a 和b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。

　　叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有：
　　1.原子吸收光谱法：通过测定镁元素的含量，进而间接计算叶绿素的含量。
　　2.分光光度法：利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯—比尔定律计算出提取液中各色素的含量。
　　叶绿素a和叶绿素b在645nm和663nm处有最大吸收，且两吸收曲线相交于652nm处。因此测定提取液在645nm、663nm、652nm波长下的吸光值，并根据经验公式可分别计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。

　　三、仪器、原料和试剂
　　仪器：分光光度计、电子顶载天平(感量0.01g)、研钵、棕色容量瓶、小漏斗、定量滤纸、吸水纸、擦境纸、滴管。
　　原料：新鲜(或烘干)的植物叶片
　　试剂：1.96％乙醇(或80％丙酮)；2. 石英砂；3. 碳酸钙粉

　　四、操作步骤
　　取新鲜植物叶片(或其它绿色组织)或干材料，擦净组织表面污物，去除中脉剪碎。称取剪碎的新鲜样品2g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3mL95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10mL，继续研磨至组织变白。静置3～5min。
　　取滤纸1张置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗，滤液流至100mL 棕色容量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。
　　用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至100mL，摇匀。
　　取叶绿体色素提取液在波长665nm、645nm和652nm下测定吸光度，以95％乙醇为空白对照。

　　五、计算
　　按照实验原理中提供的经验公式，分别计算植物材料中叶绿素a、b和总叶绿素的含量。